Thèse : Structure de l'ADN libre circulant dans le plasma (ccfDNA) chez le volontaire sain : mise en évidence d'une forme nucléosomale majoritaire

Résumé

L'ADN libre circulant (ccfDNA) est un biomarqueur de plus en plus utilisé en biopsie liquide. Pour détecter une altération tumorale, l’ADN qui la porte doit atteindre la circulation et y persister, ce qui dépend de sa fragmentation et des formes sous lesquelles il circule, encore mal étudiées.
Cette thèse vise à caractériser l'organisation du ccfDNA dans le plasma avec la technologie µLAS, qui concentre l'ADN et le sépare en taille. Nous avons développé une stratégie de multi-injection qui multiplie par dix le volume analysé et abaisse la limite de détection à 11 pg/mL. Cette sensibilité permet d'analyser des sous-populations de ccfDNA isolées par fractionnement du plasma (chromatographie d'exclusion stérique, gradient de densité, centrifugation zonale) ou par immunocapture.
Dans le plasma de donneurs sains, la majorité du ccfDNA présente des propriétés compatibles avec des formes mono- et dinucléosomales libres. Une population minoritaire de fragments longs co-fractionne avec des structures plasmatiques de plus grande taille, notamment des vésicules extracellulaires. L'immunocapture de l'ADN double brin et de l'histone H3 confirme la présence de nucléosomes et montre que leur accessibilité dépend de l'environnement plasmatique. La capture de marques épigénétiques (5-méthylcytosine, H3K9me3) favorise les fragments longs, un biais à prendre en compte pour les biomarqueurs épigénétiques.
Enfin, l’analyse d’un plasma de patient atteint d'adénocarcinome pancréatique suggère une répartition différente du ccfDNA entre les fractions, ouvrant la voie à l'étude de l'organisation de l'ADN tumoral circulant et de son effet sur sa détection.

Abstract

Circulating cell-free DNA (ccfDNA) is an increasingly used biomarker in liquid biopsy. However, detecting a tumour-associated alteration requires the fragment carrying it to reach the bloodstream and persist until sampling. This depends on its fragmentation and on the molecular forms in which it circulates, which remain poorly characterised.
This thesis aimed to characterise the organisation of ccfDNA in plasma using µLAS technology, which enables DNA concentration and size-based separation. We developed a multi-injection strategy that increased the analysed volume tenfold and lowered the limit of detection to 11 pg/mL. This increased sensitivity enabled the analysis of ccfDNA subpopulations isolated by plasma fractionation using size-exclusion chromatography, density-gradient ultracentrifugation and rate-zonal centrifugation, as well as by immunocapture.
In plasma from healthy donors, most ccfDNA exhibited properties consistent with free mono- and dinucleosomes. A minor population of longer fragments co-fractionated with larger plasma structures, including extracellular vesicles. Immunocapture targeting double-stranded DNA and histone H3 provided further evidence for the presence of circulating nucleosomes and showed that target accessibility depends on the plasma environment. Immunocapture of epigenetic marks (5-methylcytosine and H3K9me3) preferentially recovered longer fragments, revealing a size-dependent bias that should be considered when analysing epigenetic biomarkers.
Finally, analysis of plasma from a patient with pancreatic ductal adenocarcinoma revealed a different distribution of ccfDNA across plasma fractions compared with healthy donors. Although preliminary, this observation opens the way to investigating whether circulating tumour DNA displays a distinct macromolecular organisation and whether this organisation influences its persistence and detection in plasma.