Thèse : Comment les cellules régulent-elles leur croissance sous confinement spatial ?

Résumé

De la colonie microbienne au tissu épithélial et à la tumeur solide, les cellules qui prolifèrent dans des espaces confinés exercent une pression mécanique sur leur environnement, tandis que leur taux de croissance décline. Cette pression induite par la croissance (GIP) couple production de masse, expansion volumique et état physique intracellulaire, mais l'étape limitante reliant confinement mécanique et baisse de production protéique demeure non résolue. La part respective de la signalisation canonique de stress et des effets directs de l'encombrement macromoléculaire (macromolecular crowding) n'est pas davantage établie.
Cette thèse aborde ces questions chez Saccharomyces cerevisiae en combinant confinement microfluidique, imagerie à molécule unique, RNA-seq absolu spike-in, protéomique quantitative et lectures biophysiques sur cellules vivantes. Deux plateformes PDMS ont été développées pour l'occasion : une puce étroite à auto-fermeture pour l'imagerie sous apport nutritif uniforme, et une puce de récupération sous pression pour l'échantillonnage biochimique en vrac sous GIP définie. La mesure indépendante de chaque étape de la cascade d'expression identifie la transcription comme nœud limitant dominant. À 0,5 MPa, l'ARNm par cellule et le flux transcriptionnel global chutent à environ 40 % de la valeur non confinée, tandis que traduction et dégradation varient faiblement ou compensent, ce qui maintient l'abondance protéique.
À l'échelle moléculaire, l'élongation Pol II et l'engagement Pol II–chromatine sont préservés, mais la liaison coopérative de Gal4 et l'échange intra-burst au promoteur sont sélectivement affaiblis. L'échange de TF proximal de l'initiation apparaît ainsi comme une étape sensible à la pression. Le RNA-seq corrigé par spike-in, couplé à WGCNA, révèle une répression graduée du programme de croissance avec induction sélective des modules glucides de réserve et glycérol, sans activation globale de Hog1, Msn2/4 ou Gcn4. De façon inattendue, ni Sfp1 ni Tod6 ne présentent de relocalisation nucléo-cytoplasmique détectable sous GIP sub-MPa, alors que les deux rapporteurs répondent normalement à la rapamycine et au choc osmotique : la répression chronique Ribi/RP ne semble donc pas passer par l'export nucléaire canonique de Sfp1 ou Tod6 dans ce régime. Physiquement, la densité de masse sèche augmente linéairement avec la pression, ATP et pH restent stables jusqu'à environ 0,6 MPa, et le suivi des GEMs montre que la diffusion nucléoplasmique est plus étroitement couplée au taux de croissance que la diffusion cytoplasmique.
La GIP n'agit donc pas comme un signal de stress aigu mais entraîne un ralentissement coordonné du programme de croissance. La pression est détectée à l'initiation de la transcription, réoriente un programme de gènes centré sur Ribi/RP par des voies qui ne se réduisent pas aux voies canoniques de régulation de la croissance, et s'accompagne d'un nucléoplasme plus dense et plus contraint.

Abstract

From microbial colonies and biofilms to epithelial tissues and solid tumors, cells proliferating in confined spaces exert mechanical pressure on their surroundings while their growth rate declines. This growth-induced pressure (GIP) couples mass production, volume expansion, and intracellular physical state, yet the rate-limiting step linking mechanical confinement to reduced protein production remains unresolved. The relative contribution of canonical stress signaling versus direct physicochemical effects of macromolecular crowding is likewise unclear.
This thesis addresses these questions in Saccharomyces cerevisiae by combining microfluidic confinement, single-molecule imaging, spike-in absolute RNA-seq, quantitative proteomics, and live-cell biophysical readouts. Two PDMS platforms were developed for this work: a narrow self-closing chip preserving spatially uniform nutrient supply for imaging, and a pressure-recovery chip enabling bulk biochemical sampling under defined GIP. Independent measurement of every step of the expression cascade identifies transcription as the dominant rate-limiting node. At 0.5 MPa, per-cell mRNA and global transcription flux fall to about 40% of the unconfined value, while translation and degradation change weakly or compensate, so that protein abundance is maintained.
At the molecular level, Pol II elongation rate and bulk Pol II–chromatin engagement are preserved, but cooperative Gal4 binding and within-burst exchange at the promoter are selectively weakened. Initiation-proximal TF exchange thus emerges as a pressure-sensitive step. Spike-in-corrected RNA-seq combined with WGCNA reveals a graded repression of the growth program with selective induction of storage-carbohydrate and glycerol modules, rather than broad activation of a Hog1-, Msn2/4-, or Gcn4-dependent stress response. Unexpectedly, neither Sfp1 nor Tod6 shows a detectable nuclear-cytoplasmic relocalization under sub-MPa GIP, even though both reporters respond normally to rapamycin and osmotic shock, indicating that the chronic Ribi/RP repression is not transmitted through canonical Sfp1 or Tod6 nuclear export in this regime. Physically, intracellular dry mass density increases approximately linearly with pressure, ATP and pH remain stable up to about 0.6 MPa, and GEM tracking shows that nucleoplasmic mesoscale diffusion is more tightly coupled to growth rate than cytoplasmic diffusion.
GIP therefore does not act as an acute stress signal but drives a coordinated downshift of the growth program. Pressure is sensed at transcription initiation, reshapes a Ribi/RP-centered growth gene program through routes that go beyond the canonical growth-regulatory pathways, and is accompanied by a denser, more constrained nucleoplasm.