Thèse : Pénétration de nanoparticules dans des tissus biologiques modèles à l'aide d'une puce microfluidique

Résumé

La nanomédecine, c’est-à-dire l’utilisation de nanoparticules à visée médicale, est un domaine en plein essor, notamment pour le traitement des tumeurs. Elle permettrait une action ciblée et localisée, contrairement aux méthodes classiques de traitement comme la radiothérapie ou la chimiothérapie. Un des obstacles majeurs à l’application clinique de la nanomédecine réside dans le fait que les nanoparticules ont du mal à pénétrer en profondeur dans les tumeurs, ce qui empêche un traitement efficace. Pour étudier cette problématique, des modèles de tumeurs sont utilisés, tel que le sphéroïde multicellulaire. Le sphéroïde présente l’avantage de posséder une architecture tridimensionnelle comparable à celle d’une tumeur, contrairement aux cultures classiques en 2D. De plus, la microfluidique s’avère être un outil versatile permettant de réaliser des tests de pénétration de nanoparticules à haut débit, caractéristique nécessaire au vu des nombreux paramètres susceptibles d’altérer cette pénétration. La microfluidique permet notamment de contrôler précisément l’environnement physico-chimique autour des modèles de tumeur utilisés. Les contraintes mécaniques appliquées dans une puce peuvent être représentatives de caractéristiques rencontrées in vivo, telles que la pression induite par la croissance tumorale ou le cisaillement engendré par la circulation sanguine. Parmi les facteurs influençant l’efficacité de pénétration figurent, d’une part, les propriétés des nanoparticules utilisées, comme leur taille, leur charge, leur forme ou même leur type. D’autre part, les modèles in vitro utilisés peuvent également influencer l’efficacité de pénétration. Même si le sphéroïde possède des avantages, il ne reproduit pas le microenvironnement tumoral, composé de types cellulaires associés à la tumeur comme les cellules stromales (fibroblastes) et les cellules immunitaires (cellules dendritiques, macrophages), ainsi que d’une matrice extracellulaire riche en collagène, acide hyaluronique et protéoglycanes. Tous ces composants du microenvironnement tumoral peuvent altérer la pénétration de nanoparticules.
Au cours de cette thèse, nous avons développé une puce microfluidique permettant d’immobiliser cinq sphéroïdes en parallèle tout en les exposant à des perturbations physico-chimiques. L’immobilisation des sphéroïdes dans la puce repose sur le principe de l’aspiration par micropipette. Cette spécificité permet d’appliquer un stress mécanique aux sphéroïdes par aspiration, tout en les exposant à un changement de milieu qui génère un cisaillement et permet également leur exposition aux nanoparticules. Le suivi de l’exposition et de la pénétration des nanoparticules est réalisé par microscopie confocale. Concernant le système utilisé, nous avons choisi d’étudier la pénétration de cubosomes sur des sphéroïdes issus des lignées A338 RFP (cancer pancréatique murin) et S180 GFP (sarcome murin). Les cubosomes sont des nanoparticules lipidiques autoassemblées, de structure cristalline cubique, capables d’encapsuler de nombreux types de composés (hydrophiles, hydrophobes, amphiphiles). La pénétration de ces particules innovantes s’est révélée difficile dans les modèles étudiés : l’accumulation des nanoparticules reste localisée dans les premières couches des sphéroïdes, que ce soit avec ou sans contrainte mécanique. Cette accumulation pourrait s’expliquer par une forte internalisation des cubosomes par les cellules individuelles ; une fois internalisées, les particules ne semblent pas capables de ressortir des cellules. Néanmoins, la puce microfluidique développée s’avère être un outil versatile pour l’étude de la pénétration de nanoparticules dans des objets biologiques modèles.

Abstract

Nanomedicine, that is, the use of nanoparticles for medical purposes, is a rapidly expanding field, particularly for the treatment of tumors. It could allow for targeted and localized action, unlike conventional treatment methods such as radiotherapy or chemotherapy. One of the major obstacles to the clinical application of nanomedicine lies in the fact that nanoparticles struggle to penetrate deep into tumors, which prevents effective treatment. To investigate this issue, tumor models are used, such as the multicellular spheroid. The spheroid offers the advantage of possessing a three-dimensional architecture comparable to that of a tumor, unlike conventional 2D cultures. Moreover, microfluidics proves to be a versatile tool that enables high-throughput nanoparticle penetration assays, a necessary characteristic given the numerous parameters likely to alter this penetration. In particular, microfluidics allows precise control of the physicochemical environment surrounding the tumor models used. The mechanical constraints applied within a chip can be representative of characteristics encountered in vivo, such as the pressure induced by tumor growth or the shear stress generated by blood circulation. Among the factors influencing penetration efficiency are, on the one hand, the properties of the nanoparticles used, such as their size, charge, shape, or even their type. On the other hand, the in vitro models used can also influence penetration efficiency. Although the spheroid has its advantages, it does not reproduce the tumor microenvironment, which is composed of tumor-associated cell types such as stromal cells (fibroblasts) and immune cells (dendritic cells, macrophages), as well as an extracellular matrix rich in collagen, hyaluronic acid, and proteoglycans. All these components of the tumor microenvironment can alter nanoparticle penetration.
During this thesis, we developed a microfluidic chip capable of immobilizing five spheroids in parallel while exposing them to physicochemical perturbations. The immobilization of the spheroids within the chip relies on the principle of micropipette aspiration. This feature makes it possible to apply mechanical stress to the spheroids through aspiration, while exposing them to a change of medium that generates shear stress and also enables their exposure to nanoparticles. The monitoring of nanoparticle exposure and penetration is carried out by confocal microscopy. Regarding the system used, we chose to study the penetration of cubosomes in spheroids derived from the A338 RFP (murine pancreatic cancer) and S180 GFP (murine sarcoma) cell lines. Cubosomes are self-assembled lipid nanoparticles with a cubic crystalline structure, capable of encapsulating many types of compounds (hydrophilic, hydrophobic, amphiphilic). The penetration of these innovative particles proved difficult in the models studied: nanoparticle accumulation remains localized in the outermost layers of the spheroids, whether with or without mechanical stress. This accumulation could be explained by a strong internalization of the cubosomes by individual cells; once internalized, the particles do not appear to be able to exit the cells. Nevertheless, the microfluidic chip developed proves to be a versatile tool for studying nanoparticle penetration in model biological objects.