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Laboratoire d’analyse et d’architecture des systèmes
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18327
12/10/2018

Développement d'un système autonome de détection et de quanti-cation des microARNs avec une plateforme nano/uidique pour la prise en charge du cancer du pancréas

J.CACHEUX

MEMS

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, 12 Octobre 2018, 193p., Président: L.BUSCAIL, Rapporteurs: E.DELAMARCHE, I.VAN SEUNINGEN, Examinateurs: A.CARRIER, Directeurs de thèse: P.CORDELIER, T.LEICHLE , N° 18327

Lien : https://hal.laas.fr/tel-01922268

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Abstract

85% of patients affected by pancreatic adenocarcinoma (PDA) are diagnosed at an advanced stage, preventing effective care and curative treatments. Therefore, it is urgent to identify reliable biomarkers for the early detection of disease status, including relapse. MiRNAs (micro ribonucleic acids) are biomarkers of PDA, with demonstrated clinical value for early detection of tumors and monitoring of response to treatment. However, current methods of extraction and detection of miRNA are not compatible with clinical use. New technologies derived from micro and nanofabrication methods have the potential to facilitate the implementation of diagnostic tests, by offering a high degree of portability and robustness, short time to results at low cost. Here, we propose a nanofluidic platform coupled to fluorescence detection for the real time measurement of molecular interactions in a confined environment. We first describe the detection platform via a one-dimension theoretical model based on molecular dynamics to predict the capture of miRNAs into biofunctionalized nanochannels. The originality of the system lies in the non-homogeneous hybridization of miRNA targets onto the sensor. We demonstrate that the analysis of the spatial hybridization profile enables the determination of the affinity of the captured miRNA with the probe sequence in a wash-free single step. We then show the rapid discrimination (less than 10 minutes) of single nucleotide difference (SND) using this strategy. The performance of the device in the context of pancreatic cancer detection is discussed: the effect of sample preparation of complex biofluids is studied and two labeling approaches compatible with the detection of endogenous miRNAs are described and compared, leading to the detection of miRNAs extracted from model cell cultures of pancreatic cancer.

Résumé

85% des patients atteints de cancer du pancréas présentent au diagnostic des formes avancées de la maladie qui empêchent leur prise en charge thérapeutique efficace. Il est donc urgent de mettre en évidence des marqueurs diagnostics permettant de détecter plus tôt ces cancers, mais également leur rechute, afin d’améliorer leur prise en charge. Les miARNs (micro acides ribonucléiques) sont des biomarqueurs du cancer du pancréas, présentant une valeur clinique démontrée pour la détection précoce des tumeurs et le suivi de la réponse au traitement. Cependant, les méthodes actuelles d’extraction et de détection de ces molécules ne sont pas adaptées à une utilisation clinique. Les nouvelles technologies issues des méthodes de micro et nanofabrication ont le potentiel de permettre la mise en place de tests diagnostiques, offrant un haut degré de portabilité et de robustesse, une lecture en temps réel, et à bas coût. Nous proposons ici une plateforme nanofluidique couplée à une détection en fluorescence permettant la mesure en temps réel d’interactions moléculaires en milieu hyper-confiné. Nous décrivons dans un premier temps la plateforme de détection via un modèle théorique à une dimension basé sur la dynamique moléculaire permettant de prédire la capture spécifique des miARNs dans un nanocanal fonctionnalisé. L’originalité du système réside dans une accroche non homogène des miARNs sur la surface du capteur. Ainsi, nous démontrons que l’étude du profil spatial d’hybridation engendré permet de déterminer l’affinité du miARN capturé avec la séquence sonde en une seule étape, sans lavage. Nous démontrons également l’excellente spécificité du biocapteur qui permet la discrimination rapide (moins de 10 minutes) de SND (single nucleotide difference). Les performances du dispositif pour des applications au plus près des problématiques biologiques dans le cadre de la détection du cancer du pancréas sont enfin discutées : les effets de la préparation d’échantillon types biofluides complexes sur l’extraction de miARNs sont étudiés, puis deux approches permettant la détection de miARNs endogènes sont décrites et comparées, conduisant à la détection de miARNs extraits de cultures cellulaires modèles du cancer du pancréas.

Mots-Clés / Keywords
Cancer du pancréas; microARNs; Nanofluidique; Microscopie en fluorescence; Pancreactic cancer; Nanofluidics; Fluorescence microscopy;

144935
18294
09/10/2018

Growth of InAs and Bi1-xSbx Nanowires on Silicon for Nanoelectronics and Topological Qubits by Molecular Beam Epitaxy

D.DHUNGANA

MPN

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, 9 Octobre 2018, 174p., Président: F.CRISTIANO, Rapporteurs: A.LEMAITRE, E.P.A.M.BAKKERS, Examinateurs: Y.ANDRE, Directeurs de thèse: S.PLISSARD , N° 18294

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Résumé

Grâce à leur propriétés uniques, les nanofils d’InAs et de Bi1-xSbx sont important pour les domaines de la nanoélectronique et de l’informatique quantique. Alors que la mobilité électronique de l’InAs est intéressante pour les nanoélectroniques; l’aspect isolant topologique du Bi1-xSbx peut être utilisé pour la réalisation de Qubits basés sur les fermions de Majorana. Dans les deux cas, l’amélioration de la qualité du matériau est obligatoire et ceci est l’objectif principal cette thèse où nous étudions l’intégration des nanofils InAs sur silicium (compatibles CMOS) et où nous développons un nouvel isolant topologique nanométrique: le Bi1-xSbx. Pour une compatibilité CMOS complète, la croissance d’InAs sur Silicium nécessite d’être autocatalysée, entièrement verticale et uniforme sans dépasser la limite thermique de 450 ° C. Ces normes CMOS, combinées à la différence de paramètre de maille entre l’InAs et le silicium, ont empêché l’intégration de nanofils InAs pour les dispositifs nanoélectroniques. Dans cette thèse, deux nouvelles préparations de surface du Si ont été étudiées impliquant des traitements Hydrogène in situ et conduisant à la croissance verticale et auto-catalysée de nanofils InAs compatible avec les limitations CMOS. Les différents mécanismes de croissance résultant de ces préparations de surface sont discutés en détail et un passage du mécanisme Vapor-Solid (VS) au mécanisme Vapor- Liquid-Solid (VLS) est rapporté. Les rapports d’aspect très élevé des nanofils d’InAs sont obtenus en condition VLS: jusqu’à 50 nm de diamètre et 3 microns de longueur. D’autre part, le Bi1-xSbx est le premier isolant topologique 3D confirmé expérimentalement. Dans ces nouveaux matériaux, la présence d’états surfacique conducteurs, entourant le coeur isolant, peut héberger les fermions de Majorana utilisés comme Qubits. Cependant, la composition du Bi1-xSbx doit être comprise entre 0,08 et 0,24 pour que le matériau se comporte comme un isolant topologique. Nous rapportons pour la première fois la croissance de nanofils Bi1-xSbx sans défaut et à composition contrôlée sur Si. Différentes morphologies sont obtenues, y compris des nanofils, des nanorubans et des nanoflakes. Leur diamètre peut être de 20 nm pour plus de 10 microns de long, ce qui en fait des candidats idéaux pour des dispositifs quantiques. Le rôle clé du flux Bi, du flux de Sb et de la température de croissance sur la densité, la composition et la géométrie des structures à l’échelle nanométrique est étudié et discuté en détail.

Abstract

InAs and Bi1-xSbx nanowires with their distinct material properites hold promises for nanoelectronics and quantum computing. While the high electron mobility of InAs is interesting for nanoelectronics applications, the 3D topological insulator behaviour of Bi1-xSbx can be used for the realization of Majorana Fermions based qubit devices. In both the cases improving the quality of the nanoscale material is mandatory and is the primary goal of the thesis, where we study CMOS compatible InAs nanowire integration on Silicon and where we develop a new nanoscale topological insulator. For a full CMOS compatiblity, the growth of InAs on Silicon requires to be self-catalyzed, fully vertical and uniform without crossing the thermal budge of 450 °C. These CMOS standards, combined with the high lattice mismatch of InAs with Silicon, prevented the integration of InAs naowires for nanoelectronics devices. In this thesis, two new surface preparations of the Silicon were studied involving in-situ Hydrogen gas and in-situ Hydrogen plasma treatments and leading to the growth of fully vertical and self-catalyzed InAs nanowires compatible with the CMOS limitations. The different growth mechanisms resulting from these surface preparations are discussed in detail and a switch from Vapor-Solid (VS) to Vapor-Liquid-Solid (VLS) mechanism is reported. Very high aspect ratio InAs nanowires are obtained in VLS condition: upto 50 nm in diameter and 3 microns in length. On the other hand, Bi1-xSbx is the first experimentally confirmed 3D topololgical insulator. In this new material, the presence of robust 2D conducting states, surrounding the 3D insulating bulk can be engineered to host Majorana fermions used as Qubits. However, the compostion of Bi1-xSbx should be in the range of 0.08 to 0.24 for the material to behave as a topological insulator. We report growth of defect free and composition controlled Bi1-xSbx nanowires on Si for the first time. Different nanoscale morphologies are obtained including nanowires, nanoribbons and nanoflakes. Their diameter can be 20 nm thick for more than 10 microns in length, making them ideal candidates for quantum devices. The key role of the Bi flux, the Sb flux and the growth temperature on the density, the composition and the geometry of nanoscale structures is investigated and discussed in detail.

144673
18336
21/09/2018

Engineered micro-devices for the isolation of circulating tumor cells in clinical routine

A.K.JIMENEZ ZENTENO

ELIA

Doctorat : 21 Septembre 2018, 190p., Président: J.GRISOLIA, Rapporteurs: E.DELAMARCHE, J.R.GREER, Examinateurs: C.PICART, S.VERBRIDGE, U.DEMIRCI, Directeurs de thèse: C.VIEU, A.CERF , N° 18336

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Résumé

Les cellules tumorales circulantes (CTCs) sont la principale voie de dissémination du cancer dans le corps humain au travers de la circulation sanguine. Ces cellules ont la capacité de se détacher de la tumeur primaire, de rejoindre la circulation sanguine et de survivre dans cet environnement. Une sous-population spécifique de ces cellules a la capacité de coloniser de nouveaux tissus et de former des métastases. L'importance de ces cellules rares dans la circulation sanguine a été intensément étudiée au cours des dernières décennies, et il a été constaté que les informations phénotypiques et génomiques qu'elles contiennent pourraient être corrélées avec celles obtenues à partir d'une biopsie tissulaire. De plus, le nombre et l'incidence des CTC chez les patients métastatiques pourraient être utilisés comme indicateurs pronostics. Ainsi, leur isolement à partir d'échantillons sanguins et leur analyse a été proposé en remplacement des biopsies conventionnelles, comme une alternative moins invasive et permettant un échantillonnage plus répété. In fine, la détection et l'analyse des CTC en routine clinique pourraient être utilisées pour le suivi en temps réel des thérapies et de leur efficacité pour améliorer la prise en charge des patients, un pas de plus vers une médecine de précision. Dans ce projet de thèse, nous avons développé de nouveaux micro-dispositifs pour la capture, sous flux, de cellules cancéreuses à partir de sang complet humain. Nous avons exploité les propriétés physiques des CTC, plus grandes et moins déformables que les cellules sanguines normales, pour discriminer ces cellules rares (<1 cellule par mL aux premiers stades de la maladie). Des micro-dispositifs ont été conçus tels des tamis à trois dimensions pour filtrer sélectivement les cellules cancéreuses tout en préservant l'intégrité et la viabilité des cellules. De plus, les dispositifs ont été conçus pour permettre l'accès au matériel biologique isolé et effectuer ainsi une identification des cellules in situ, e.g. par immunocytochimie, mais aussi potentiellement pour servir de plateforme pour une analyse fonctionnelle de ces cellules. Nous avons proposé deux approches totalement compatibles avec la routine clinique. La première consiste en un guide équipé de microdispositifs, conçu pour être introduit directement dans la circulation sanguine au travers d'un cathéter médical et effectuer la capture des cellules cancéreuses in vivo. La deuxième approche vise à réaliser l'isolement des CTCs en utilisant des microdispositifs intégrés à des plateformes ex vivo compatibles avec les consommables médicaux de prélèvement sanguin. Les deux développements technologiques ont été validés en utilisant des cellules issues de lignée cancéreuse en suspension dans un milieu de culture cellulaire ou dans du sang complet Notre approche in vivo a été optimisée sur la base d'observations réalisées à l'aide d'un banc fluidique mimant une veine artificielle et a été testée avec succès in vivo dans un modèle animal. Ce prototype a démontré sa robustesse et sa capacité à capturer des cellules cancéreuses à des concentrations proches des concentrations en situation métastatique. Une évaluation de la sensibilité a été réalisée de la même manière pour l'approche ex vivo, démontrant des performances de capture analogues. Nous croyons que ces technologies pourraient permettre des prélèvements de CTC de manière répétée et fiable pour le pronostic et le suivi thérapeutique des patients métastatiques.

Abstract

Circulating tumor cells (CTCs) are believed to represent the main pathway of cancer dissemination in the human body through the circulatory system. These cells have the ability to detach from the primary tumor, enter into the bloodstream, and survive in this environment. A specific subpopulation of these cells possesses the capacity of colonizing new tissues and forming metastases. The relevance of these rare cells in the bloodstream has been intensively investigated during the last decades, finding that phenotypic and genomic information they carry could be correlated with that of solid biopsies. Moreover, the number and incidence of CTCs in metastatic patients could be used as an indicator for prognosis. Thus, their isolation from blood samples and analysis has been proposed as a surrogate to solid biopsies, having the added value of being a less invasive procedure and allow a more repeated measure. In fine, the routine analysis of CTCs in clinical practice could be used for the real-time monitoring of therapies and the adaptation of treatment in order to improve the outcome of patients, a step forward towards so-called precision medicine. In this PhD project, we have developed novel micro-devices for the capture, in flow conditions, of tumor-derived cells from human whole blood. CTCs being larger and less deformable than normal blood cells, we exploited theses physical traits to discriminate them. Sieve-like micro-devices were engineered to selectively sort out tumor-derived cells having as a priority the preservation of cell integrity and viability. In addition, devices were designed to allow direct access to the isolated biological material and thus perform in situ cell identification, such as immunocytochemistry, but also to potentially serve as a platform for functional analysis. We proposed two approaches compatible with clinical routine. The first approach consists in a customized guiding-strip equipped with integrated microfilters, designed to be introduced directly within the bloodstream through a conventional medical catheter to perform the capture of tumor-derived cells in vivo. The second approach aims to perform CTC isolation ex vivo through the integration of microfilters into a platform compatible with blood collection medical sets. Both technological developments were validated using a cancerous cell line suspended in either cell culture medium or whole blood. Our in vivo approach was optimized using a customized fluidic bench mimicking an artificial human vein and was tested successfully in an animal model. This prototype demonstrated its robustness and capability to capture tumor-derived cells in concentrations within the range found in metastatic patients. This sensitivity appraisal was carried out for the ex vivo approach, demonstrating analogous capture performances. We believe that these technologies could enable repeated and reliable CTC detection for prognosis and monitoring of treatment efficiency in metastatic patients.

Mots-Clés / Keywords
Liquid-biopsy; CTCs; Cancer-monitoring; Microfabrication; Microfiltration; 3D-microdevices; Biopsie liquide; Surveillance du cancer; Microdispositifs 3D;

144953
18160
23/05/2018

Conception et réalisation de microdispositifs électrochimiques, pour l’analyse de l’activité bioénergétique de mitochondries isolées, dans le cadre de la mise au point de traitements innovants des leucémies aiguës myéloïdes

G.LEMERCIER

MICA

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, Mai 2018, 179p., Président: L.CASTEILLA, Rapporteurs: P.MAILLEY, R.ROSSIGNOL, Examinateurs: R.FERRIGNO, S.ARBAULT, P.TEMPLE-BOYER, Directeurs de thèse: J.E.SARRY, J.LAUNAY , N° 18160

Lien : https://hal.laas.fr/tel-01856647

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Abstract

The role of mitochondria have been restricted to oxidative phosphorylation for a long time. Now it is clear that they are also the main sources of reactive oxygen species, implied in oxidative stress and cell-to-cell signaling. Thus, mitochondrial malfunction is potentially the cause of the appearance and the progression of diseases linked to ageing like cancers and neurodegenerative troubles. In the frame of acute myeloid leukemia, studies governed by Jean-Emmanuel Sarry of the Cancer Research Center of Toulouse, showed that it is possible to improve the efficacy of current chemotherapies by targeting mitochondria’s function. In this context, the objective of the thesis presented here consist in the design and the manufacturing of electrochemical micro-sensors, dedicated to the analysis of the metabolic activity of isolated mitochondria. The manufacturing occurred in the clean room facilities of the Laboratory for Analysis and Architecture of Systems of Toulouse under the supervision of Jérôme Launay and Pierre Temple-Boyer, researchers specialized in the development of solutions aiming the detection of species diluted in solution. Finally, a complete system ensuring the coupling with microscopy and fluidics have been realized, validated, and patented. The results obtained allow us to consider the analysis at the scale of the single mitochondrion with a parallelized approach, thing that have never been made.

Résumé

La mitochondrie est restée longtemps cantonnée au rôle de centrale énergétique cellulaire. On sait désormais qu’elle est aussi la principale source d’espèces réactives oxygénées, impliquées dans le stress oxydant et la signalisation inter-cellulaire. Le dérèglement de l’activité mitochondriale est ainsi susceptible d’être la cause de l’apparition et de la progression de maladies associées au vieillissement, comme le cancer et les maladies neurodégénératives. Dans le cadre de la leucémie aiguë myéloïde, des études menées par l’équipe dirigée par Jean-Emmanuel Sarry du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse, ont montré qu’il est possible de sensibiliser les cellules jusqu’alors résistantes à la chimiothérapie, en ciblant préalablement la fonction mitochondriale. C’est dans ce contexte que s’inscrit le sujet de cette de thèse, portant sur la conception et la réalisation de micro-capteurs électrochimiques dédiées à l’analyse du métabolisme mitochondrial, à l’échelle de la mitochondrie isolée. La fabrication des microsystèmes s’est déroulée dans la salle blanche du Laboratoire d’Analyse et d’Architecture des Systèmes de Toulouse, sous l’encadrement des chercheurs Jérôme Launay et Pierre Temple-Boyer, spécialisés dans la conception de capteurs pour la détection d’espèces en phase liquide. Finalement, un système complet assurant le couplage à la microscopie et à la gestion des fluides a été fabriqué, validé, et breveté. Les résultats obtenus nous permettent d’envisager l’analyse à l’échelle de la mitochondrie unique par une approche parallélisée, ce qui n’a encore jamais été réalisé.

143853
18145
19/03/2018

Conception d’un système d’analyse multi-capteur ISFET pour la surveillance in situ de l’azote minéral. Application à la culture du blé dur

M.JOLY

MICA

Doctorat : INSA de Toulouse, 19 Mars 2018, 184p., Président: J.Y.FOURNIOLS, Rapporteurs: W.WROBLEWSKI, F.LE BIHAN, Examinateurs: T.TALLEC, S.HOUOT, Directeurs de thèse: P.TEMPLE BOYER, J.LAUNAY , N° 18145

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Abstract

Excessive use of nitrogen fertilizers in modern agricultural practices is a concern as it leads to groundwater pollution and eutrophication of fresh and marine waters. Soil testing can enable the introduction of new agricultural practices that take more into account temporal and local variations of soil and plants. This work therefore aims at the development of an in situ, autonomous and communicating analysis system for real-time monitoring of the mineral nitrogen contents of soils. Our system is based on the Ion-Sensitive Field Effect Transistor (ISFET) microsensor technology. A first step of its development was dedicated to the fabrication of generic pH-ISFET microsensors. The problem of determining soil pH by inserting pH-ISFETs directly into the soil was considered. Results obtained by this in situ method were compared with the standard method and we examined the influence of soil (moisture, texture, pH) and ISFET parameters (lifetime, time drift). In a second step, pNH4-ISFET and pNO3-ISFET chips were obtained by functionalizing the generic pH-ISFET chips with ionosensitive membranes. The composition of these membranes has been optimized until detection properties (sensitivity, selectivity, stability, etc.) were in good accordance with the ammonium and nitrate ion contents of cultivated soils. Characterizations under in situ conditions were then carried out. Finally, the integration in the ground, the protection, the power supply and the remote communication of the sensors were made possible by the integration in a dedicated system. We obtained promising results.

Résumé

L’usage excessif de fertilisants azotés dans les pratiques agricoles modernes est préoccupant car il aboutit, entre autres, à la pollution des nappes phréatiques et à l’eutrophisation des eaux douces et marines. L’analyse du sol peut faciliter la mise en place de nouvelles pratiques agricoles qui tiennent davantage compte des variations temporelles et locales du sol et des plantes. Ces travaux visent donc le développement d’un système d’analyse in situ, autonome et communicant pour le suivi en temps réel des teneurs en azote minéral du sol. Notre système est basé sur la technologie de microcapteur chimique en silicium Ion- Sensitive Field Effect Transistor (ISFET). Une première phase de son développement a été dédiée à la fabrication de microcapteurs génériques pH-ISFET. La problématique de la détermination du pH du sol en insérant les pH-ISFET directement dans le sol a été considérée. Les résultats obtenus par cette méthode in situ ont été comparés avec la méthode standard et nous avons examiné l’influence de paramètres propres au sol (humidité, texture, pH) et à l’ISFET (durée de vie, dérive temporelle). Dans un second temps, des puces pNH4-ISFET et pNO3-ISFET ont été obtenues en fonctionnalisant les puces génériques pH-ISFET grâce à l'intégration de membranes ionosensibles. La composition de ces membranes a été optimisée jusqu’à obtention de propriétés de détection (sensibilité, sélectivité, stabilité…) en adéquation avec les teneurs en ions ammonium et nitrates typiques des sols cultivés. Des premières caractérisations en conditions in situ ont alors été effectuées. Finalement, les capteurs ont été intégrés à un système permettant l’insertion des capteurs dans le sol, leur protection, l’alimentation électrique par batterie et la communication à distance des données de mesure. De premiers résultats, prometteurs, ont été obtenus.

Mots-Clés / Keywords
ISFET; Agriculture; Analyse in situ du sol; Membranes ionosensibles; Intégration; Capteurs autonomes communicants; Cycle de l’azote; Microfabrication; In situ soil analysis; Ionosensitive membranes; Integration; Autonomous and communicating sensors; Nitrogen cycle;

143793
18379
31/01/2018

Microenvironnements pour l’analyse biologique et l’ingéniérie des tissus

L.MALAQUIN

ELIA

Habilitation à diriger des recherches : 31 Janvier 2018, 149p., Président:, Rapporteurs: M.C.JULLIEN, S.LEGAC, C.NIZAK, Examinateurs: O.FRANCAIS, L.CASTEILLA, Directeur: G.LANDA, Membre invité: C.VIEU , N° 18379

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Résumé

Au sein des tissus vivants, les cellules forment une communauté organisée et en interaction dans d’une matrice extra cellulaire. De ce microenvironnement cellulaire, naissent les mécanismes responsables de l’homéostasie ou de la dégénérescence des tissus qui sont étroitement liés à la topologie ainsi qu’à la distribution spatiale des propriétés physico-chimiques et biologiques. Ainsi, la fabrication de modèles mimétiques permettant de reproduire, en trois dimensions, les paramètres physiques et chimiques essentiels du microenvironnement, est devenu un enjeu majeur en biologie et en médecine. Dans cet objectif, les technologies microfluidiques et de bioimpression apparaissent comme des outils particulièrement performants pour créer des modèles de microenvironnements propices à la manipulation de liquides biologiques, à leur traitement à des fins d’analyse ou d’étude de la prolifération cellulaire. Cette soutenance sera dédiée, dans un premier temps, à une présentation des projets de recherches menés au sein de l’institut Curie puis au sein du LAAS CNRS autour du développement de de concepts microfluidiques pour la réalisation de dispositifs miniaturisés d’analyse (pré-concentration, capture et analyse de biomarqueurs et de cellules) ou de diagnostic cellulaire (capture de cellules tumorales circulantes, analyse génétique). Dans un deuxième temps seront présentées les évolutions de ces activités de recherche vers le développement de modèles standardisés de microenvironnements cellulaires sur la base de technologies d’impression 3D et de bioimpression.

145273
18015
11/01/2018

Système microfluidique µLAS pour l’analyse de l’ADN résiduel : Application au diagnostic de la maladie de Huntington et à l’analyse de l’ADN circulant

R.MALBEC

MICA

Doctorat : INSA de Toulouse, 11 Janvier 2018, 238p., Président: P.CORDELIER, Rapporteurs: X.GIDROL, V.TALY, Examinateurs: P.JOSEPH, J.SAMITIER, Directeurs de thèse: A.BANCAUD , N° 18015

Lien : https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01744797

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Abstract

DNA fragments are circulating in the bloodstream. Circulating DNA fragments size, concentration or sequence are analytical information for the clinician or the molecular biology specialists. For instance, circulating DNA, stem from tumoral cells, can serve as biomarkers for cancer detection and follow up. Collecting those information may be difficult for samples presenting minute amount of DNA. In practice, detecting and analyzing residual DNA, with the relevant level of sensitivity, ask for the development and the association of analytical technologies, such as electrophoresis, to molecular biology techniques, such as PCR amplification. In the prospect of simplifying and speeding up the processes, we have developed and optimized µLAS, a microfluidic system for the simultaneous concentration, separation and detection of residual DNA. Furthermore, µLAS has been applied to the diagnostic of Huntington’s disease and the analysis of residual DNA circulating in the bloodstream. Huntington’s disease, is caused by the expansion of CAG/CTG repeats on the Huntingtin gene, and provoke neurological degeneration. The diagnostic of Huntington’s disease consist in amplifying and measuring this expansion. As the amplification of trinucleotide repeat is far from reliable, we benefit from µLAS sensitivity to reduce the number of amplification cycles, and the time to result. Additionally, for the sensitive analysis of circulating DNA by µLAS, we have proposed an original approach, aiming to reduce the blood sample pre-analytical steps to a simple enzymatic digestion followed by a centrifugation step. Finally, the development of a function for the detection of specific sequences has been made by the selective concentration of a target of interest hybridized to a probe. This approach which use some probes fluorescently labelled in volume, has been patented.

Résumé

La distribution en taille, la concentration, ou la séquence des fragments d’ADN circulants dans le sang sont autant d’informations analytiques exploitables pour les cliniciens ou les spécialistes de la biologie moléculaire. Par exemple, l’ADN circulant, issu de cellules tumorales, peut servir de biomarqueur pour la détection et le suivi du cancer. L’accès à ces informations est d’autant plus difficile que la quantité d’ADN dans l’échantillon est faible. En pratique, pour atteindre des niveaux de sensibilité adaptés, la détection et l’analyse de résidus d’ADN requiert le développement et l’association de technologies d’analyses de type électrophorèse aux techniques de la biologie moléculaire telles que l’amplification PCR. Dans la perspective de simplifier et d’accélérer les procédures, nous avons développé et optimisé µLAS, un système microfluidique pour la concentration, la séparation et la détection simultanée de l’ADN résiduel. µLAS a ensuite été appliqué au diagnostic de la maladie de Huntington et à l’analyse de l’ADN résiduel circulant dans le sang. La maladie de Huntington, causée par l’expansion de répétitions CAG/CTG sur le gène Huntingtin, est à l’origine d’une dégénérescence neurologique. Le diagnostic de la maladie de Huntington consiste à amplifier et à mesurer la taille de cette expansion. L’amplification de répétitions trinucléotidiques étant peu fiable, nous profitons de la sensibilité de µLAS, pour réduire le nombre de cycles d’amplification, et donc le temps d’analyse. Par ailleurs, pour l’analyse sensible de l’ADN circulant par µLAS, nous avons proposé une approche originale, visant à réduire les manipulations pré-analytiques de l’échantillon sanguin à une simple digestion enzymatique suivie d’une centrifugation. Enfin le développement d’une fonction de détection spécifique de séquence a été réalisée par concentration sélective d’une cible d’intérêt hybridée à une sonde. Cette approche qui utilise des sondes marquées en fluorescence en volume, a notamment fait l’objet d’un brevet.

Mots-Clés / Keywords
ADN; Analyse; Microfluidique; Diagnostic; Cancer; Maladie de Huntington; DNA; Analysis; Microfluidic; Huntington’s disease;

142313
17452
28/11/2017

Functionalized double-walled carbon nanotubes for integrated gas sensors

L.YANG

ELIA

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, 28 Novembre 2017, 145p., Président: K.ARAUJO-GUERIN, Rapporteurs: C.DEJOUS, M.ARAB, Examinateurs: G.VIAU, Directeurs de thèse: V.VIEU, E.FLAHAUT , N° 17452

Lien : https://hal.laas.fr/tel-01675535

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Résumé

Nous proposons dans ce travail une méthode robuste et bas-coût afin de fabriquer des détecteurs de gaz à base de Nanotubes de Carbone bi-parois (DWCNTs) chimiquement fonctionnalisés. Ces nano-objets (DWCNTs) sont synthétisés par dépôt catalytique en phase vapeur (CCVD), puis purifiés avant d’être oxydés ou bien fonctionnalisés par des terminaisons fluorées ou aminées. Les dispositifs de détection électriques ont été fabriqués par lithographie douce en utilisant un pochoir de PDMS (Poly-DiMethyl Siloxane) et un dépôt en phase liquide à la pipette d’une suspension aqueuse contenant les nanotubes fonctionnalisés, rinçage puis séchage à l’azote sec. Chaque dispositif (1 cm X 2 cm) est équipé d’un jeu de 7 résistors à base de DWCNTs. Chaque résistor peut accueillir des nanotubes fonctionnalisés par une entité chimique différente afin de cibler un gaz spécifique, permettant ainsi une détection multiplexée. En raison de leur faible encombrement et la possibilité de les fabriquer sur tout type de substrat y compris des substrats souples, ces détecteurs pourraient être utilisés pour une large gamme d’applications et notamment les détecteurs de gaz portatifs et intégrés. La résistance électrique des résistors s’avère décroître avec la température suggérant une conduction électrique gouvernée par l’effet tunnel et les fluctuations au sein du tapis désordonné de nanotubes de carbone. Nous avons cependant montré dans ce travail que pour des applications réelles de détection de gaz, une régulation thermique des dispositifs n’est pas nécessaire car les variations de résistance engendrées par l’adsorption de molécules de gaz sont significativement plus grandes que les variations causées par de possibles fluctuations de température. Les dispositifs produits présentent un caractère métallique à température ambiante et pour des applications de détection de gaz nous avons sélectionné des dispositifs présentant des résistances inférieures à 100 kΩ. Le principe de base de la détection de gaz étant basé sur la mesure directe de la résistance électrique du dispositif, la consommation électrique de ces dispositifs reste faible (<1 μW). La réponse des dispositifs à base de nanotubes de carbone non fonctionnalisés aux analytes testés (éthanol, acétone, ammoniac et vapeur d’eau) est faible. Les nanotubes de carbone fonctionnalisés présentent quant à eux, une réponse modérée à la vapeur d’eau, à l’éthanol et à l’acétone mais montrent une sensibilité excellente à l’ammoniac. En particulier, les nanotubes de carbone oxydés se sont avérés capables de détecter des concentrations sub-ppm d’ammoniac en présence de vapeur d’eau en excès et à température ambiante et ont montré une grande stabilité dans le temps même pour des expositions de gaz répétées. Nous pensons que les groupes chimiques fonctionnels ancrés à la surface des nanotubes de carbone modifient les interactions entre les molécules de gaz et les nanotubes et que le transfert de charges induit provoque les modifications de la conductance électrique du système. Nous avons construit un modèle phénoménologique pour analyser les réponses électriques de nos dispositifs lors de l’exposition d’un gaz. Ce modèle prend en compte une variation exponentielle de la résistance au cours du temps puis un régime d’accroissement linéaire de cette résistance. Nous montrons en particulier que la constante de temps extraite du régime exponentiel est très informative sur la sensibilité et la sélectivité du détecteur de gaz. Nous avons finalement testé nos dispositifs pour des applications représentatives comme par exemple la détection de traces d’ammoniac qui ont pu être aisément réalisées à des concentrations bien inférieures au seuil de détection du nez humain (0.04ppm). En raison de leur grande stabilité, facilité de fabrication (design très simple, technologies de fabrication bas coût, intégration sur substrats souples), robustesse (détection possible en présence de vapeur d’eau et résiliente aux fluctuations thermiques) et en raison de la faible quantité de nanotubes de Carbone nécessaire, nous pensons que nos résultats sont intéressants pour des applications de masse concernant des détecteurs de gaz portables pour l’industrie des technologies de l’information et de la communication.

Abstract

We have successfully fabricated gas sensors based on chemically functionalized double-wall carbon nanotubes (DWCNTs) using a robust and low cost process. The DWCNTs were synthesized by catalytic chemical vapor deposition (CCVD) method. They were then purified before functionalization (oxidation, amination, and fluorination). The sensor devices were fabricated by soft lithography using PDMS (Poly-DiMethylSiloxane) stencils and liquid phase pipetting of a suspension of chemically functionalized DWCNTs in deionized water, rinsing and finally drying in a nitrogen flow. Each device (1 cm x 2 cm) is equipped with a set of 7 DWCNT based resistors. Each resistor can accommodate a precise chemical functionalization for targeting a specific gas species, allowing a multiplexed (up to 7) detection. Due to their small size and the possibility to fabricate them on soft substrates, they could be used for many kinds of applications including wearable devices. The electrical resistance of the produced resistors turned out to decrease with temperature, suggesting fluctuations induced tunneling conduction through the disordered network of metallic nanotubes. However, we have shown in our work that for realistic applications, gas sensing can be achieved without any temperature regulation of our devices, because the variations of electrical conductance caused by gas molecules adsorption are significantly larger than those caused by possible temperature fluctuations. The as fabricated devices exhibit at room temperature a metallic conducting behavior. Devices with a resistance less than 100 kΩ were selected for gas detection. Because the sensing principle is based on the direct measurement of the resistance, our scheme ensures low power consumption (<1 μW). Raw (not functionalized) DWCNTs-based gas sensors exhibited a low sensitivity to the tested analytes, including ethanol, acetone, ammonia and water vapor. Functionalized DWCNTs-based gas sensors exhibited a moderate sensitivity to ethanol, acetone and water vapor but the response to ammonia, even in the presence of additional water vapor, was excellent. In particular, oxidized DWCNTs based gas sensors exhibited a high stability in the case of prolonged and repeated gas exposures. The oxidized DWCNTs gas sensors were also able to detect ammonia vapor at sub-ppm concentration in the presence of water vapor at high concentration. We believe that the functional groups grafted to the DWCNTs modify the interaction between gas molecules and DWCNTs and that the induced charge transfer is responsible for the modification of the electrical conductivity. We have built a simple phenomenological model for the analysis of the sensing response curve. This model includes two components for the variations of electrical resistance during gas exposure, an exponential regime and a linear one. In particular, the time constant extracted from the exponential part of the response was found to be informative on devices' sensitivity and selectivity. Finally, we tested our sensors for realistic applications such as trace detection of ammonia, which could be easily detected while far below the detection threshold of human nose (0.04ppm) Due to the high stability, ease of fabrication (very simple design, use of low-cost technologies, integration on flexible substrates), robustness (detection in the presence of a large excess of water vapor and resilient to temperature fluctuations) and extremely low amounts of carbon nanotube required, we expect these results to have some potential for a wide range of mass applications in the field of wearable gas sensors for Information and Communication Technologies (ICT) industry.

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17/10/2017

Développement d’un capteur à base de polymère à empreintes moléculaires pour la quantification de la sphingosine 1-phosphate libre et circulante comme biomarqueur du mélanome cutané

M.SAHUN

ELIA

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, 17 Octobre 2017, 155p., Président: T.LEVADE, Rapporteurs: L.DUMA, O.SOPPERA, C.MASQUEFA, Examinateurs: J.FITREMANN, Directeurs de thèse: N.ANDRIEU-ABADIE, A.CERF , N° 17425

Lien : https://hal.laas.fr/tel-01660830

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Abstract

Melanoma is the most aggressive and severe form of cutaneous cancer due to its high metastatic potential. However, to date, no marker for the early detection of melanoma has been unanimously accepted. Our group has demonstrated that ceramide metabolism is strongly altered in melanoma, leading to the overproduction of sphingosine 1-phosphate (S1P), one of its derivatives. S1P is secreted by melanoma cells and has been identified as a critical molecule of tumor microenvironment remodeling that supports cancer progression. Physiologically, circulating S1P is predominantly linked to high density lipoproteins (HDLs), low and very low density lipoproteins (LDLs and VLDLs), as well as albumin. Melanoma cells produce unbound S1P that could be responsible for the effects induced by this lysophospholipid on the tumor microenvironment, as a result of its binding to S1PR receptors present on the surface of stromal cells. Thus, secreted tumor S1P could represent a new biomarker for the early detection of melanoma. However, there are currently no means to quantify it. The goal of this interdisciplinary work was to develop a new sensor based on a Molecularly Imprinted Polymer (MIP) in order to quantify unbound S1P present in the blood of melanoma patients. This study has been conducted between the “Engineering for Life science Applications (EliA)” group at the Laboratory for Analysis and Architecture of Systems (LAAS) and the “Sphingolipids, metabolism, cell death and tumor progression” group at the Cancer Research Center of Toulouse (CRCT), in strong collaboration with the team “Biomimetism and Bioinspired Structures” of the University of Technology of Compiègne (UTC). First, we synthesized a new MIP against S1P employing a bulk thermopolymerization approach. The resulting MIP was characterized and optimized by performing both mass spectrometry and fluorescence spectroscopy measurements. It was compared to a Non Imprinted Polymer (NIP) and exposed to S1P analogues to assess its selectivity. Second, in order to use the MIP as the sensitive layer of a future sensor and prepare its immobilization and structuration onto a transducer, we synthesized a new surface photopolymerizable MIP. This MIP was first structured by photolithography onto silicon substrates and validated by fluorescence microscopy measurements. The MIP was also structured as a thin layer onto Quartz Crystal Microbalance (QCM) chips in order to validate its binding capacities using this label-free method. Finally, the use of a MIP-coated optical fiber as an infrared sensor was explored, with the aim of detecting S1P in blood using Attenuated Total Reflectance (ATR) spectroscopy.

Résumé

Le mélanome est le plus agressif et le plus sévère des cancers cutanés du fait de son fort potentiel métastatique. Pourtant à ce jour, aucun biomarqueur pour la détection précoce du mélanome n’est unanimement reconnu. Notre groupe a récemment démontré que le métabolisme du céramide est fortement altéré dès les premiers stades de la maladie, conduisant à l’augmentation de la production d’un dérivé du céramide, la sphingosine 1-phosphate (S1P). La S1P est sécrétée par les cellules du mélanome et a été identifiée comme une molécule majeure du remodelage du microenvironnement tumoral, qui favorise la progression du cancer. De façon physiologique, la S1P circulante se trouve majoritairement sous forme liée aux protéines de haute densité (HDLs), aux protéines de basse et très basse densité (LDLs et VLDLs) ainsi qu’à l’albumine. Les cellules de mélanome pourraient produire de la S1P non liée qui pourrait rendre compte des effets produits par ce lysosphopholipide sur les cellules du microenvironnement tumoral suite à sa fixation sur les récepteurs S1PR présents à la surface des cellules stromales. Ainsi, cette forme libre de S1P pourrait représenter un nouveau biomarqueur pour la détection précoce du mélanome. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun moyen permettant de la quantifier. Le but de ce travail interdisciplinaire a été de développer un nouveau capteur basé sur un polymère à empreintes moléculaires (MIP) dans le but de quantifier la S1P libre dans le sang de patients atteints de mélanome. Cette étude a été réalisée entre l’équipe « Ingénierie pour les sciences du vivant (ELiA) » du Laboratoire d’Analyse et d’Architecture des Systèmes (LAAS), et l’équipe « Sphingolipides, métabolisme, mort cellulaire et progression tumorale » du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT), en étroite collaboration avec l’équipe « Biomimétisme et structures bioinspirées » de l’Université Technologique de Compiègne (UTC). Dans un premier temps, nous avons synthétisé un nouveau MIP dirigé contre la S1P par une méthode de thermopolymérisation en masse. Nous avons caractérisé puis optimisé ce MIP en effectuant des mesures de spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide et des mesures de spectroscopie de fluorescence. Le MIP a été comparé à un NIP (Non Imprinted Polymer) et exposé à des analogues de la S1P afin d’évaluer sa sélectivité. Dans un second temps, en vue de l’utilisation d’un MIP en tant que couche sensible d’un futur capteur et pour anticiper son immobilisation et sa structuration sur le transducteur, nous avons mis au point un nouveau MIP photopolymérisable en 2D. Ce MIP a d’abord été structuré en motifs par photolithographie sur des surfaces de silicium puis validé par des mesures de microscopie de fluorescence. Le MIP a également été structuré sous la forme de couches minces sur les surfaces actives de capteurs de Microbalance à Cristal de Quartz (QCM) dans le but de le valider par cette méthode sans marquage. Enfin, nous avons exploré l'utilisation d'une fibre optique recouverte d'une couche de MIP photopolymérisé dans le but de détecter, par spectroscopie infrarouge, la liaison de la S1P avec le MIP à la surface de la fibre.

Mots-Clés / Keywords
Mélanome cutané; Biomarqueurs; Sphingosine 1-Phosphate; Capteur;

141673
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17/10/2017

Développement de transistors à effet de champ à base de nanofils de silicium pour la détection en phase liquide

A.LALE

MICA

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, Octobre 2017, 229p., Président: J.GRISOLIA, Rapporteurs: T.BARON, A.C.SALAUN, Examinateurs: W.SANT, B.CAUSSAT, Directeurs de thèse: P.TEMPLE BOYER, J.LAUNAY , N° 17520

Lien : https://hal.laas.fr/tel-01713026

Diffusable

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Abstract

Ion-sensitive field effect transistors (ISFET) are electronic components designed to operate in liquid phase. To summarize, they are MOSFET-based devices whose metal gate is replaced by an ionosensitive insulating layer. In the early 2000s, these components evolved with the introduction of the first device based on silicon nanowires. Thanks to their small dimensions, these sensors opened up new perspectives, such as the study of intracellular metabolisms. The aim of this thesis was to develop and study a type of ISFET sensor, based on silicon nanowires, with Al2O3 alumina as sensitive layer. The first part of this work was focused on the integration of thin alumina Al2O3 films in a MOSFET process. This material had to be deposited on silicon nanowires, that is why Atomic Layer Deposition (ALD) was used. This method allows to deposit films with uniform thickness all around nanowires. After the study of ALD-Al2O3, the second major part of this project was to develop innovative structures, based on silicon nanowires, using microelectronics methods. Transistors consisting of a single nanowire, and others consisting of parallel networks of nanowires were fabricated. These sensors were integrated in microfluidic channels, allowing to precisely locate the liquid on nanowires and also to work in micro/nanovolumes. The last part of this project consisted in characterizing these sensors in liquid phase. The different configurations showed their advantages and disadvantages in terms of transconductance, leakage currents, slopes below the threshold, sensitivities to pH and interfering ions (Na+ and K+). The characterizations proved to be excellent and suggest interesting prospects for biological applications. The main innovations of these sensors are: the use of suspended nanowires, the realisation of a bilayer SiO2/Al2O3 ion-sensitive sheath all around the nanowires, the doping variation along the nanowires which led to the realization of N+/P/N+ junctions, and the integration of sensors into covered microfluidic channels.

Résumé

Les transistors à effet de champ sensibles aux ions (ISFET) sont des composants électroniques conçus pour fonctionner en phase liquide. Pour résumer, ce sont des MOSFET dont la grille métallique est remplacée par une membrane isolante ionosensible. Au début des années 2000, ces composants ont évolué avec l’introduction des premiers dispositifs à base de nanofils de silicium. Grâce à leurs faibles dimensions, ces capteurs ont ouvert de nouvelles perspectives, comme par exemple, l’étude des métabolismes intracellulaires. L’objectif de cette thèse a été de développer et d’étudier un capteur de type ISFET, à base de nanofils de silicium, ayant comme couche sensible l’alumine Al2O3. Les premiers travaux ont porté sur l’intégration de films minces d'alumine Al2O3 dans un procédé de type MOSFET. Ce matériau devant être déposé sur des nanofils de silicium, la technique de dépôt successif de couches moléculaires (Atomic Layer Deposition ALD) a été retenue. Cette méthode offre la possibilité de déposer des films d’épaisseur homogène tout autour des nanofils. Après l’étude de l’ALD-Al2O3, la deuxième grande partie de ce projet a consisté à développer, en utilisant les techniques de la microélectronique, des structures innovantes à base de nanofils de silicium. Des transistors constitués d’un seul nanofil, et d’autres constitués de réseaux parallèles de nanofils ont été réalisés. Ces capteurs ont été intégrés dans des canaux microfluidiques, permettant ainsi de localiser précisément le liquide sur les nanofils, mais aussi de pouvoir travailler en micro/nanovolumes. La dernière partie de ce projet a consisté à caractériser ces capteurs en phase liquide. Les différentes configurations ont montré leurs avantages et inconvénients en termes de transconductance, courants de fuite, pentes sous le seuil, sensibilités au pH et aux ions interférents (Na+ et K+). Les caractérisations se sont avérées excellentes et laissent entrevoir des perspectives intéressantes pour des applications biologiques. Les principales innovations de ces capteurs concernent : l’utilisation de nanofils suspendus, la réalisation d’une gaine isolante ionosensible bicouche SiO2/Al2O3 tout autour des nanofils, la variation du dopage le long des nanofils ce qui a conduit à la réalisation de jonctions N+/P/N+, et l’intégration des capteurs dans des canaux microfluidiques couverts.

Mots-Clés / Keywords
ALD; Al2O3; ISFET; ChemFET; Nanofils; Biocapteur; Nanocapteur; Microcapteurs; Phase liquide; Nanowires; Biosensor; Nanosensor; Microsensors; Liquid phase;

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