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Laboratoire d’analyse et d’architecture des systèmes
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16390
28/10/2016

Sélection et capture de biomarqueurs moléculaires et cellulaires à partir d' un fluide complexe

H.CAYRON

ELIA

Doctorat : INSA de Toulouse, 28 Octobre 2016, 207p., Président: G.FAVRE, Rapporteurs: C.A.PANABIERES, I.SAGNES, Examinateurs: A.CERF, H.CRAIGHEAD, S.DESCROIX, J.MORAN-MIRABAL, Directeurs de thèse: C.VIEU , N° 16390

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Abstract

In this XXIst century, medicine is gravitating towards the personalized care of a patient, this trend being manifested through the concept of precision medicine. In oncology particularly, the sampling of biological tissues from a tumor, or biopsy, is currently used for diagnostic purposes. Physicians are nowadays interested in the concept of “liquid biopsy”, reflecting the direct access to circulating biomarkers from various biofluids via a simple blood sampling for example, less invasive than tissue sampling, for the diagnostic and follow-up of pathologies. This research project focused on two technological approaches emerging from microfabrication for the selection and capture of circulating molecular and cellular biomarkers. At the molecular scale, this work was based on the automation of a directed capillary assembly protocol. A dedicated module was implemented into an automate for molecular stamping and validated using a simple molecular model, allowing the elongation and large-scale assembly of single biomolecules in a controlled and automatized manner. The developed technology was then used for the assembly of relevant molecular biomarkers such as cell-free DNA (cfDNA) from untreated whole blood, evidencing the capabilities of this technology to single out nucleic acids from complex fluids composed of other cellular elements. At the cellular scale, an innovative concept for Circulating Tumor Cells (CTCs) selection and capture was developed. The developed microdevice is fabricated using 3D direct laser writing and allows for a physical capture of cells from untreated whole blood while preserving them for further recovery and analysis. After having optimized the design in vitro to maximize the capture efficiency of the system, a selective capture of cancer cells from untreated whole blood was achieved. A first prototype for the in vivo use of this system was also developed and validated in vitro with cancer cells spiked into culture medium, opening up wide possibilities from an applicative and translational perspective.

Résumé

La médecine du XXIème se dirige vers une prise en charge individuelle du patient et s’inscrit dans un concept que l’on nomme médecine de précision. Dans le domaine de l’oncologie en particulier, les prélèvements tissulaires sur la tumeur, ou biopsie, sont couramment utilisés pour établir un diagnostic chez un patient donné. Les médecins s’intéressent de nos jours au concept de biopsie liquide, traduisant l’accès à des biomarqueurs circulants dans divers biofluides corporels via un simple prélèvement, sanguin par exemple, moins invasif que les prélèvements tissulaires dans le diagnostic et le suivi des pathologies. Ce travail de thèse s’est axé autour de deux approches technologiques issues du domaine de la microfabrication pour la sélection et la capture de biomarqueurs circulants, aux échelles moléculaire et cellulaire. A l’échelle moléculaire, ces travaux se sont axés sur l’automatisation d’un protocole d'assemblage capillaire dirigé. Un module a été implémenté dans un automate de tamponnage moléculaire puis validé en utilisant un modèle moléculaire simple, permettant l'isolement et l'étirement de biomolécules individuelles de manière entièrement contrôlée et automatisée à large échelle. Nous avons ensuite appliqué cette technologie à des biomarqueurs moléculaires d'intérêt tels que les ADN libres (cfDNA) contenus dans du sang complet, démontrant la capacité de la technique à isoler des acides nucléiques à partir d’un fluide complexe, ici parmi une population de cellules sanguines. A l’échelle cellulaire, une approche innovante pour la sélection et la capture de Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) a été développée. Le microdispositif mis au point est fabriqué par écriture laser à 3 dimensions et permet le piégeage physique de ces cellules dans du sang complet non traité tout en les préservant pour une récupération et analyse ultérieure. Après adaptation du microdispositif pour maximiser son efficacité de capture in vitro, une première preuve de concept de capture sélective de cellules cancéreuses dans du sang complet non traité a été réalisée. Un premier prototype pour une utilisation in vivo a été mis au point et validé in vitro sur la capture de cellules cancéreuses dans du milieu de culture, ouvrant de larges perspectives au niveau applicatif et translationnel.

Mots-Clés / Keywords
Biomarqueurs; Microtechnologies; Assemblage capillaire; Biopsie liquide; Oncologie; Lithographie 3D; Biomarkers; Capillary assembly; Liquid biopsy; Oncology; 3D lithography;

138213
16383
11/10/2016

Propriétés biophysiques des cardiomyocytes vivants en condition physio/ physiopathologique et architecture des récepteurs couplés aux protéines G explorées par microscopie à force atomique

V.LACHAIZE

ELIA

Doctorat : Université de Toulouse III - Paul Sabatier, 11 Octobre 2016, Président: J.M.SENARD, Rapporteurs: S.LABDI, P.MANIVET, Examinateurs: S.EL-KIRAT-CHATEL, Directeurs de thèse: E.DAGUE, C.GALES , N° 16383

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Abstract

Heart failure is a public health problem with 1 million patients this year in France. This pathology is defined inability to heart pump sufficiently to maintain blood flow to meet the body's needs. This decrease is explicated by the loss of contractile function of the heart, caused by the necrosis of the contractile cells: cardiomyocytes. In this study, I was able to study the topographic and biomechanical modification of the cardiomyocyte membrane upstream of its rupture during necrosis, by technology derived from nanosciences : atomic force microscopy (AFM). My work reveals a highly structured membrane in healthy cardiomyocytes and a loss of this architecture in an early stage of the heart failure installation. In a second study I was interested in the oligomeric organization of a transmembrane receptors family , G protein-coupled receptors. These proteins are a privileged target for the pharmacological treatments on heart failure such as beta- Blockers and vasodilators. This oligomerization mechanism could be the key to the side effects associated with treatments. In order to study the oligomeric conformation, I used single molecule force spectroscopy and I reveal different oligomeric populations of these receptors on the membrane. The results showed a oligomeric populations distribution according the conditions (plasmid density coding for receptors / stimulation with synthetic or natural agonist). It is possible that there is a regulation of the signaling pathways, using the oligomerization for specific activation receptors. The possible difference in activity of each oligomeric population (monomer / dimer / tetramer / hexamer) appears to be a plausible explanation for the side effects of pharmacological agents. My thesis work allowed the discovery of a new track by an innovative technology, atomic force microscopy, in the treatment of heart failure.

Résumé

L’insuffisance cardiaque est un réel problème de santé publique avec 1 millions de patients souffrant de cette pathologie cette année en France. Elle est définie incapacité de fournir un débit sanguin suffisant à l’organisme. Cette diminution de débit est traduite par la perte de fonction contractile du coeur provoqué par la nécrose des cellules responsable de cette fonction : les cardiomyocytes. Dans cette étude j’ai pu étudier les modifications topographiques et biomécaniques de la membrane du cardiomyocyte vivant en amont de sa rupture lors de la nécrose, par une technologie issue des nanosciences : la microscopie à force atomique (AFM). Mes travaux ont fait apparaitre une membrane très structurée chez le cardiomyocyte sain et une perte de cette architecture dans un temps précoce de l’installation de l’insuffisance cardiaque. L’utilisation de la microscopie électronique à transmission à montrer que les anomalies mises en évidences par AFM ont pour origine un réarrangement mitochondriale. Dans une seconde étude je me suis intéressée à l’organisation oligomérique d’une famille particulière de récepteur transmembranaire, les récepteurs couplés aux protéines G. Ces protéines sont une des cibles privilégiées pour les traitements pharmacologiques de l’insuffisance cardiaque tel que le bêta-bloquants et les vasodilatateurs. Ce mécanisme d’oligomérisation pourrait être la clef des effets secondaires liés à ces traitements. Afin d’étudier la conformation oligomérique, j’ai utilisé la spectroscopie de force à l’échelle de la molécule unique pour mettre en évidence différentes populations oligomérique de ces récepteurs sur la surface membranaire. Les résultats ont montré une distribution des populations oligomériques en fonction des conditions (densité de plasmide codants pour les récepteurs/stimulation avec agoniste synthétique ou naturel). Il est possible qu’il y ait une régulation des voies de signalisations par l’oligomérisation des récepteurs activés. La différence d’activité possible de chaque population oligomérique (monomère/dimère/tétramère/hexamère) semble être une explication plausible aux effets secondaire des agents pharmacologique. Mes travaux de thèse ont permis la mise en évidence de nouvelle piste par une technologie innovante, la microscopie à force atomique, dans le traitement de l’insuffisance cardiaque.

Mots-Clés / Keywords
Insuffisance cardiaque; Microscopie à force atomique; Cardiomyocytes; RCPG; Oligomérisation; Spectroscopie de force à l’échelle de la molécule unique; Heart failure; Atomic force microscopy; Oligomerization; Single molecule force spectroscopy;

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